液相色谱仪是实验室中经常会运用到的仪器，这里收集汇总了一些关于液相色谱仪使用的步骤和相关注意事项，帮助大家更加便捷地使用。

水相中的溶质溶解方式

水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式，因为此类溶解方式，可能会使溶质处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形（如遇有机溶剂、温度剧降等），极易析出少量结晶；而一旦析出，便将损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白色粉末”的现象。

流动相的配制与使用

1、恒度洗脱

一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A管）泵入仪器，这是使用的原则。切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）泵入仪器，即便配制了脱气机，因为此种情形极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。

剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后抽滤即可。无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼的表现。实践是检验真理的标准！实践吧~

2、梯度洗脱

流动相配制最为科学的方式是：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为低比例的水相-高比例的有机相（英国药典几乎均如此）；

其次为：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为纯有机相；最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，建议改为第二种或头一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。

梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一针测定。这10分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱损伤较大。

色谱柱的安装

标准SOP应为：

取A管路放入流动相瓶中→拧松泵头→流速由0mL/min逐渐升至10mL/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10秒→拧紧泵头→流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出，观测是否呈抛物线状，持续5秒→流速逐步降至1.0mL/min →安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端→手握两端螺丝帽，拧紧。

以上安装顺序遵循的是：

逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续一周，头一针与最末一针主成分保留时间相差在6秒以内。

试验后色谱柱的清洗

1、最为常用的C8柱、C18柱

（1）流动相仅为水或甲醇-水时

继续冲洗30分钟，流速1.0mL/min，柱温保持试验时温度，即可。

（2）水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0mL/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速1.0mL/min，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。

其后如果采用高比例的甲醇冲洗，会导致残余的有机相中水相遇到高比例的甲醇后析出少量盐和表面活性剂，从而在泵头上、色谱柱中析出，也导致了色谱柱寿命大为缩短。

2、其他类型色谱柱

查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则导致色谱柱性能急剧下降。

试验顺序

工作流程应如下进行：

1、0~2小时 配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。

2、2~3小时 采用A管路注入流动相（B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路），平衡1小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0mL/min，平衡1小时后即可开始做试验。

3、3~5小时 测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始测定。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定得过小，使得杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。

4、5~8小时 配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最末一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。切勿设定为切换至B管路洗脱，此举得不偿失。

5、9~24小时 放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定的样品（配制一份测定一针）。充分利用下班后的16小时，做到从容不迫、。如单位还无自动进样装置，建议向领导申请购买，因一台自动媲美三台手动。

6、第二天0~0.5小时 检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0mL/min，平衡30分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。

7、第二天0.5~2.0小时 如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。